免疫組化試劑盒檢測(cè)的原理是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。計(jì)算方法是以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
免疫組化試劑盒在沒有去離子水或雙蒸水時(shí),可以使用娃哈哈純凈水配制溶液,切勿使用自來水。
1.樣品稀釋:酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),如果血清不稀釋,不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽性。因此,國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒,均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),以降低非特異性反應(yīng),使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來。樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定,以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是,有些用戶未能嚴(yán)格按使用說明書操作,如產(chǎn)品應(yīng)取10u1樣品進(jìn)行稀釋,個(gè)別用戶取5u1甚至1u1樣品進(jìn)行稀釋,由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠,因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確,檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問題。
2.試劑盒平衡:試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20~30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠,樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短,ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低,可將試劑盒打開盒蓋置37℃溫箱20分鐘。稀釋前、后的樣品需要充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗(yàn)的均一性。
3.加樣:盡量操作規(guī)范,將液體垂直懸空快速加入到微孔板中,避免加到孔避上。加完試劑后用手適當(dāng)振蕩或在桌面適當(dāng)作圓周運(yùn)動(dòng),使孔內(nèi)試劑充分混勻,蓋好蓋板膜。
4.洗板:洗液盡量不要溢出孔外;加洗液后要靜置10-15s,甩去板孔中洗液后,一定要用力拍干;及時(shí)更換吸水紙,尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。